Організатори:
Одеський національний університет ім. І.І.Мечникова МОН України
Інститут мікробіології і вірусології ім.Д.К.Заболотного НАН України
Товариство мікробіологів України ім. С.М. Виноградського
Спілка біологів і біотехнологів Одеси

Теоретичний курс (30 год)

Лекція  1
Молекулярна генетика і молекулярна мікробіологія. Сучасні наукові концепції в молекулярній мікробіології. Біологічний метроном. Теорія нейтральної еволюції. Адаптивні мутації. Прокаріотно-еукаріотна дихотомія. Сучасні схеми класифікації прокаріотних і еукаріотних мікроорганізмів та вірусів. Домени життя.

Лекція 2 і 3
Первинна послідовність геномів. Методи встановлення первинної послідовності - сіквенс. Бактеріальна геноміка. Топологія цілісних бактеріальних геномів. Ортологи і паралоги. Кластери ортологічних генів (СОG). Концепція «найменшого» геному.

Лекція  4
Автономні генетичні елементи бактерій. Інсерційні послідовності, транспозони, системи рестрікції-модифікації, плазміди, бактеріофаги, острівки і острови патогенності. Ієрархія і мобільність автономних генетичних елементів. Автономні генетичні елементи і виникнення нових патогенних бактерій.

Лекція  5
Бактеріальні віруси. Сучасна класифікація бактеріофагів. Фаги з хвостовими відростками – порядок Caudovirales. Помірні і вірулентні бактеріофаги. Стратегія розвитку каудовірусів. Віруси бактерій і архебактерій. Фаги ентеробактерій і молочнокислих бактерій. Фаготерапія.

Лекція  6
Геноміка профагів і островів патогенності. Фагова лізогенна конверсія. Фагові токсини. Концепція «моронів». Острови патогенності і система секреції III типу.

Лекція  7
Дефектні бактеріофаги і бактеріоцини. Роль в міжбактеріальному антагонізмі. Перспективи використання бактеріоцинів – типування бактерій, біоконтроль бактеріальних популяцій і терапія раку.

Лекція  8
Геноміка плазмід. Плазмідні детермінанти патогенності. Вектори на основі плазмід. Молекулярна генетика плазміди pTi – С58 Agrobacterium tumifaciens. Трансгенні рослини.

Лекція  9
Бактеріальні транспозони, ІS-елементи, інтегрони і генетичні касети. Формування множинної антибіотикостійкості у бактерій. Концепція внутрішньогеномних перебудов – геномний інженірінг.

Лекція  10
Екологія вірусів бактерій. Поширення і роль в глобальних обмінах речовини. Нові методи в екології бактеріофагів. Світовий океан і віріопланктон.

Лекція 11
Поняття про кластерний аналіз. Вимірювання спорідненості об'єктів. Проблема адекватності мір спорідненості та характеристики спорідненості організмів.

Лекція 12
Методи кластерного аналізу. Алгоритми прямої класифікації. Визначення кластерів. Алгоритми розрахунку кластерного аналізу, які застосовуються у біології. Критерії якості класифікації.

Лекція 13
Поняття нумеричної таксономії. Ієрархічні алгоритми. Застосування кластерного аналізу в нумеричній таксономії і філогенії.

Практичний курс (90 год)

Лабораторне заняття 1
Фаги порядку Caudovirales. Бактеріофаги Escherichia coli: Т7 (родина Podoviridae), лямбда (Syphoviridae), Р1 і Т4 (Myoviridae). Класифікація. Морфотипи, організація віріонів. Віріонна ДНК.
Титрування фагів. Фагові бляшки (плаки), їх зв`язок з морфотипом, розміром віріонів та природою вірусів.
Препаративне одержання фагових часток. Метод злитного лізису чутливої культури. Концентрування фагових часток методом ПЕГ-преципітації (процедура Ямамото)
Виділення віріонної ДНК. Правила роботи з ДНК.
Рестрикційний аналіз. Ідентифікація бактеріальних вірусів за рестрикційними патернами їх геномів.

Лабораторне заняття 2
Молекулярна генетика помірного коліфага Р1. Загальна і спеціалізована Р1-трансдукція генетичних маркерів. Плазмідний профаг. Фагова система рестрикції-модифікації ЕсоР.
Температурна індукція лізогена E. coli С600 [P1::Tn9 (Cmсts 100)].
Одержання та тестування Р1-лізогенів.
Плазмідні профілі лізогенів.
Обмеження продуктивного розвитку бактеріофага лямбда в клітинах   E. coli (Р1) за рахунок R/М системи ЕсоР1.
Лізогенізація фагом P1::Tn9 клітин Erwinia carotovora.
Інкорпорація транспозона Tn9 в криптичну плазміду рСА25 E.carotovora.

Лабораторне заняття 3
Плазмідні профілі бактерій. Форма і розмір позахромосомних кільцевих ДНК.
Особливості виділення плазмід у грамнегативних бактерій із природних екологічних ніш. Лужний метод Kado і Liu.
Ізоляція плазмідного профага Р1 та плазмід ентеробактерій F, RP4, pCA25, рСА25::Tn9. Електрофоретичне розділення плазмідної ДНК. Залежність електрофоретичної рухливості ДНК від її розміру.

Лабораторне заняття 4
Іонообмінна та гель фільтраційна хроматографія віріонів та їх компонентів.
Принципи рідинної хроматографії.
Хроматографія високого та низького тиску.
Сучасне обладнання для хроматографії.
Виділення віріонів фага Р1 та Т7. Аналіз профілів елюції.

Лабораторне заняття 5
Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) – синтез певного фрагменту ДНК in vitro. Різновиди ПЛР. ПЛР-діагностика бактеріального раку винограду:  виявлення послідовностей Ті-плазміди патогенних штамів Agrobacterium tumefaciens і Agrobacteriumvitis. Метод “біо-ПЛР” у діагностиці хвороб рослин. Правила роботи у ПЛР-лабораторії.
Виділення плазмідної ДНК методом теплового лізису бактеріальних клітин. Реакційні суміші для проведення ПЛР.
Ампліфікація послідовностей Ті-плазміди штамів Agrobacterium tumefaciens і Agrobacterium vitis. 
Електрофорез продуктів ПЛР.

Лабораторне заняття 6
Застосування кластерного аналізу при побудові родинних зв'язків. Побудова філограм за допомогою комп'ютерних програм.
Множинне вирівнювання як попередній етап при аналізі родинних зв'язків.
Знайомство з основними пакетами програм, які застосовуються у філогенії (програми on-line).
Знайомство з програмою з аналізу первинної послідовності і побудова на її основі філограм (пакет MatLab).

  Причетність таких автономних генетичних елементів (АГЕ) як плазміди, бактеріофаги і транспозони до формування нових варіантів бактерій, більш адаптованих до умов оточуючого середовища, за рахунок горизонтального перенесення генів патогенності є безперечним науковим фактом сучасної бактеріології, а також одним з аспектів загальнобіологічної проблеми, безпосередньо пов'язаної з горизонтальним потоком генів у бактеріальних популяціях і асоціаціях. Завдяки перенесенню генів між спорідненими бактеріями, які заселяють певну екологічну нішу розширюються їх адаптивні можливості, а також з'являються нові штами і формується біологічна різноманітність. 
  Відомо, що прояв патогенності у ентеробактерій має безпосереднє відношення до автономних генетичних елементів. На теперішній час найбільш ґрунтовно досліджено АГЕ інфекційно небезпечних бактерій, де їх причетність до патогенних процесів не викликає ніякого сумніву.

Тема: Лізис як стратегія розвитку бактеріофага Т7 Escherichia coli.
Морфологія і структура ДНК фага Т7

  Бактеріофаг Т7  є типовим представником родини фагів Т7 і звичайно вважається облігатно вірулентним фагом.  Генетичну карту фага Т7 було побудовано у 1969 році. В цей час також було виявлено і досліджено  декілька фагових ферментів,  які приймають участь у  реплікації і транскрипції ДНК. Завдяки цьому Т7 швидко зосередив на собі увагу вчених. З бактеріофагом Т7 досить легко працювати у лабораторії, він швидко росте і зараз є добре дослідженим. Усі ці переваги зробили Т7 провідною модельною системою для експериментальної молекулярної еволюції і еволюційної генетики. 
  Бактеріофаг Т7 дає великі зони лізису на газоні E. coli, які продовжують зростати зі збільшенням терміну інкубації. Т7 не спричиняє постійної контамінації в лабораторних умовах через те, що швидко гине при висиханні.  
  Геном фага Т7 має  39 937 п.н. і складається з 56 відомих або потенційних генів. На кінцях генома Т7 існують прямі півтори розміром 160 п.н.  Також встановлено, що in vitro після рестрикції ендонуклеазами можуть утворюватись кільцеві форми, які не були виявлені in vivo.

1-й день

Приготування нічної культури E. coli ВЕ

Хід роботи. Бактеріальною культурою E. coli ВЕ, яка виросла на твердому МПА,  інокулюємо 3 мл МПБ. Інкубуємо 8 – 12 годин при 37ºС.

2-й день

Титрування фага Т7

Хід роботи .

1. Нічну культуру E. coli ВЕ розводимо 1:50. Для цього до 3 мл МПБ додаємо 60 мкл нічної культури. Інкубуємо 2 години при 37ºС до концентрації 2х10⁸ кл/мл.
2. Титрування бактеріофага Т7 здійснюємо методом серійних десятикратних розведень. Для цього з вихідного штока фага Т7 відбираємо 100 мкл фаголізата і вносимо у 900 мкл стерильного МПБ. Отримуємо перше десятикратне розведення, де ступінь вмісту фагових часток складає 10^-1  відносно вихідного фаголізата, а кратність розведення - 10¹. Новим накінечником відбираємо 100 мкл з отриманого першого розведення і вносимо у 900 мкл стерильного МПБ. Отримуємо друге десятикратне розведення, кратність розведення фаголізата в якому складає 10² відносно вихідного фаголізата і т.д. У наступні 900 мкл бульону додаємо 100 мкл попереднього розведення. Готуємо таким чином 5 розведень. Наприкінці усі розведення будуть мати об´єм по 900 мкл, а останнє - 1000 мкл. Розведення зберігаємо у холодильнику.
3. Фагові розведення висіваємо методом двошарових агарових чашок. Для цього стовпчик з м´яким МПА (вміст агара 0,5%) об´ємом 5 мл розтоплюємо на водяній бані (воду доводимо до кипіння). Охолоджуємо водяну баню зі стовпчиком до 55ºС.
4. В охолоджений стовпчик з м´яким МПА додаємо 500 мкл двогодинної культури E.coli ВЕ і 100 мкл фагового розведення, трохи збовтуємо і акуратно виливаємо на чашку з шаром твердого МПА (вміст агара 1,5%). Даємо застигнути при кімнатній температурі.
5. Двошарові чашки інкубуємо 18 – 20 годин при 37°С.
6. Готуємо нічну культуру E.coli ВЕ (див. День 1)

3-й день

Титрування фага Т7(продовження)

Титр фагових часток підраховуємо за формулою Т= (n/m) x R, де
Т – титр фага;
n – кількість негативних колоній;
m– об´єм суспензії, що висівається на чашку, в мл – 0,005мл
R – кратність розведення.

Препаративне отримання фага Т7 методом злитного лізису

Підходящим розведенням фаголізата для накопичення фагових часток у препаративних кількостях будет те розведення, яке дає злитний лізис при висіванні його на чашку з чутливою культурою. Злитний лізис утворюється тоді, коли фагові бляшки розташовуються щільно одна до одної по усій поверхні агарового шару. При цьому можуть бути помітними межі бляшок, але культура чутливої бактерії у газоні відсутня.
Хід роботи

1. Готуємо двогодинну культуру E.coli ВЕ (див. День 2, п.1).
2. Після підрощування культури висіваємо на чашки розведення фага, яке дає злитний лізис методом двошарових агарових чашок (див. День 2, п. 2,3,4)
3. Готуємо нічну культуру E.coli ВЕ (див. День 1)

4-й день   

Концентрування часток фага Т7 методом ПЕГ-преципітації (процедура Ямамото)

Хід роботи

1. Чашку Петрі зі злитним лізисом чутливої культури заливаємо 10 мл МПБ і шпателем Дригальского знімаємо шар верхнього агара у стерильну колбу.
2. До суспензії додаємо приблизно 1 мл хлороформа.
3. Агар розбиваємо на магнітній мішалці при 4 ºС 1,5-2 години.
4. Отриману суспензію центрифугуємо 45 хвилин при 5000 об./хв, при +10º С.
5. Після центрифугування надосадову рідину зливаємо у стерильну колбу, а осад повторно відмиваємо половинним об´ємом МПБ. Супернатант після відмивання з´єднуємо з попереднім та зберігаємо при +4ºС. Стерилізуємо хлороформом.

Процедура Ямамото

1. У стерильний пеніциліновий флакон переносимо 5 мл отриманого фаголизата.
2. До нього додаємо 10 % поліетиленгліколя (ПЕГ) 6 000 - 500мг, залишаємо у холодильнику для розчинення.
3. Після розчинення ПЕГ додаємо 292 мг NaCl. Кінцева концентрація NaCl може складати від 1 до 0,5 М. Залишаємо у холодильнику на ніч.

5-й день

Концентрування часток фага Т7 методом ПЕГ-преципітації (продовження)

1. Центрифугуємо 5 мл фаголізата 15 хвилин при 5 000 об./хв.
2. Осад ресуспендуємо в 0,5 мл буфера для концентрування наступного складу: 10 мМ трис НСl, рН 7,5, 50 мМ NaCl.
3. Отриману суспензію переносимо у пробірку Епендорфа і додаємо 0,3 мл хлороформа. Струшуємо приблизно 5 хвилин.
4. Центрифугуємо 5 хвилин при 11 000 об./хв на мікроцентрифузі ELMI.
5. Супернатант переносимо у стерильну пробірку Епендорфа і додаємо 200 мкл хлороформа. Струшуємо 5 хвилин.
6. Центрифугуємо 5 хвилин при 11 000 об./хв на мікроцентрифузі ELMI.
7. Супернатант (фаголізат) відбираємо у стерильну пробірку Епендорфа і зберігаємо у холодильнику при + 4 ºС.

Виділення ДНК фага Т7

При роботі з ДНК обов´язковими є рукавички і маска.
 Хід роботи

1. 500 мкл фаголізата переносимо у стерильну пробірку Епендорфа.
2. Додаємо у наступній послідовності: 75 мкл пронази В (1 мг/мл) 12,5 мкл 20 % SDS (кінцева концентрація 0,8 %).
3. Інкубуємо 10 хвилин в ультратермостаті при 60ºС (загальний об´єм суміші 587,5 мкл).
4. Додаємо у наступній послідовності: 5 мкл Na₂ЕДТА 0,25 М (кінцева концентрація 0,002 М). 60 мкл ацетата натрія 3 М (кінцева концентрація 0,3 М). 500 мкл фенола рН 7,6
5. Акуратно змішуємо.
6. Центрифугуємо 5 хвилин при 11 000 об./хв на мікроцентрифузі.
7. Верхню водну фазу переносимо у стерильну пробірку Епендорфа. На інтерфазі має осісти денатурований білок.
8. Додаємо 2 об´єми перегнаного спирту.
9. Преципітуємо при – 20ºС від 20 хвилин до 1 доби.
10. Відмиваємо 4 рази у спирті від фенола. Для цього осаджуємо преципітовану ДНК 5 хвилин при 11 000 об./хв на мікроцентрифузі. Акуратно зливаємо спирт і перевертаємо пробірку Епендорфа на фільтрувальний папір для підсушування на 2-5 хвилин.
11. Додаємо 500 мкл перегнаного спирта.
12. Осаджуємо 5 хвилин при 11 000 об./хв на мікроцентрифузі і так само ще три рази. Критерієм «відмитої» ДНК є відсутність запаха фенола з пробірки.
13. Після цього просушуємо ДНК 20 хвилин, перевернувши пробірку на фільтрувальний папір.
14. Додаємо 200 мкл стерильної дистильованої води і залишаємо пробірку в холодильнику на 15 хвилин - 3 години.
15. Для зберігання у водний розчин ДНК додаємо трис НСl, рН 7,5 до кінцевої концентрації 10 мМ. ДНК зберігають у холодильнику.

6-й день

Рестрикційний аналіз ДНК фага Т7

Загальний об`єм реакційної суміші повинен складати 20 мкл.
Хід роботи

1. У стерильні пробірки Еппендорфа або мікропланшет вносимо 16 мкл стерильної дистильованої води.
2. Додаємо 2 мкл відповідного буферу для рестриктази.
3. 3. Додаємо 1 мкл фагової ДНК.
4. Додаємо 1 мкл рестриктази.
5. Інкубуємо 1,5-2 години при 37 ºС.
6. Додаємо 4 мкл стоп-буферу. Зразок у такому вигляді можна зберігати при – 20 ºС.
7. Зразок об`ємом 10 мкл вносимо в лунку 1% агарозного геля. Електрофорез здійснюємо в трис-фосфатному буфері, рН 7,9.

Підготування електрофоретичної камери

   Готуємо 1% агарозний гель на трис-фосфатному буфері. Для цього 1 г агарози розчиняємо в 95 мл дистильованої води. Суміш нагріваємо на водяній бані, а потім доводимо до кипіння на плитці. Після повного розчинення агарози додаємо 5 мл 20-кратного трис-фосфатного буферу, рН 7,9.
Трис-фосфатний буфер х20, рН 7,9,:
0,7 М трис,
0,8 М NaH₂PO₄ ,
0,02 М Na₂ЕДТА.
Формуємо гель, камеру заповнюємо однократним трис-фосфатним буфером і перевіряємо наявність струму.
Вносимо зразки в лунки. U=40-60 V, довжина геля 6-10 см.

Тема: Лізогенія як стратегія розвитку помірних бактеріофагів. Температурна індукція профага Р1. Лізогенізація клітин штаму E. coli C600 помірним бактеріофагом Р1. Виділення плазмідного профага Р1

Одним із бактеріофагів E. coli, який використовувався для розвитку концепцій та методів молекулярної біології, є помірний бактеріофаг Р1. Всередині клітини фаг Р1 існує у вигляді стабільної автономної плазміди розміром близько 100 т.п.н. у кількості приблизно одна копія на хромосому. В інфекційних частках ДНК фага Р1 циклічно пермутована, лінійна з кінцевою надлишковістю 10-15 т.п.н. Після попадання в бактеріальну клітину вірусна ДНК замикається у кільце за рахунок рекомбінації між надлишковими послідовностями, і переходить до літичного чи лізогенного розвитку. Профаг Р1 реплікується як кільцева плазміда з точки початку реплікації (oriR) та належить до групи несумісності Y. Ця плазміда є некон'югативною, але може бути мобілізована. Р1 має широке коло хазяїв серед грам-негативних бактерій. Не дивлячись на дуже малу кількість копій, плазміда Р1 виключно стабільно успадковується. Виняткова здатність Р1 до генералізованої трансдукції зробила його провідним інструментом генетичного обміну між штамами.
Не дивлячись на малу кількість копій, профаг–плазміда Р1 втрачається з частотою приблизно 10^-5 на бактеріальну генерацію. За підтримання плазміди і збереження профагу в наступних генераціях лізогенів відповідають 4 функції: механізм розходження копій плазміди по дочірнім клітинам, система сайт–специфічної рекомбінації і типові плазмідні функції (плазмідний реплікон, постсегрегаційне вбивство, або пригнічення росту і т.і.). Функції реплікації і розходження плазміди зібрані всередині однієї області геному Р1. Вони утворюють два оперони, що транскрибуються в одному напрямку. Р1–профаг належить до великої родини плазмідних репліконів, що кодують ініціаторний білок RepA і містять значну кількість сайтів зв’язування для нього. Реплікація плазміди Р1 відбувається двоспрямовано і узгоджується з реплікацією бактеріальної хромосоми.

1-й день

Приготування нічної культури E. сoli С600(Р1ts)

Хід роботи.

Добову окрему колонію лізогена E. сoli С600(Р1ts) інокулюємо в 3 мл МПА. Інкубуємо 8-12 годин при 28 ºС.

2-й день

Температурна індукція лізогена E. сoli С600(Р1ts)

Хід роботи

1. Нічну культуру лізогена E. сoli С600(Р1ts) розводимо 1:50. Для цього до 3 мл МПБ додаємо 60 мкл нічної культури лізогена. Інкубуємо 2-3 години при 28 ºС.
2. Підрощену культуру переносимо на 37 ºС на ніч.
3. Готуємо нічную культуру E. coli C600 (див.1-й день)

 3-й день

Одержання фаголізату Р1. Лізогенізація чутливої культури

Хід роботи

1. Нічну культуру E. coli C600 розводимо 1:50. Для цього в 3 мл МПБ додаємо 60 мкл нічної культури. Інкубуємо 1,5 години при 37 ºС
2. До культури лізогена E. сoli С600(Р1ts), яка знаходилась ніч при 37 ºС, додаємо 50 – 100 мкл хлороформу. Струшуємо 5-10 хв при при 37 ºС для остаточного лізису клітин.
3. Відбираємо 1 – 1,5 мл лізату в пробірку Еппендорфа.
4. Центрифугуємо 1-2 хв в мікроцентрифузі ELMI при 11000 об/хв для осадження клітинного детриту.
5. Відбираємо біля 1 мл супернатанту без осаду, який являє собою фаголізат Р1.
6. 6. Готуємо газон чутливої культури двошаровим методом. Для цього стовпчик з м`яким МПА (вміст агару 0,5%) об`ємом 5 мл розтоплюємо на водяній бані. Охолоджуємо до 55 ºС. В охолоджений стовпчик додаємо 500 мкл 1,5-годинної культури E.coli С600, струшуємо і обережно наносимо на чашку з шаром твердого МПА (вміст агару 1,5%). Охолоджуємо при кімнатній температурі.
7. Фаголізат Р1 наносимо на застиглий газон E.coli С600 краплями по 5 – 10 мкл.
8. Інкубуємо 8 – 12 часов при 28 ºС. Якщо краплі не підсохли, чашку не перевертаємо.

4-й день

Одержання лізогенних клітин по фагу Р1

Хід роботи

1. Знімаємо шар верхнього агару із зон лізису, які утворилися на газоні E. coli C600, і переносимо його в 3 мл МПБ. Інкубуємо при 28 ºС дві години з інтенсивним помішуванням, або 5-7 годин без помішування.
2. Клітини, які проросли, висіваємо на МПА з хлорамфеніколом (20 мкг/мл) для одержання окремих колоній. Інкубуємо 8 – 12 год при 28 ºС.
3. Готуємо нічну культуру E. coli C600 (див. 1-й день).

 5-й день

Перевірка клонів на лізогенність

Хід роботи

1. Готуємо 1,5-годинну індикаторну культуру E. coli С600 (див. 3-й день, п.1) і потім - двошарову чашку з МПА з цією культурою (див. 3-й день, п.6).
2. Окремі колонії, які виросли на МПА з хлорамфеніколом, стерильними переколками переколюємо на дві наступні чашки:

№1 – матрична чашка, МПА
№2 – тест-чашка с газоном E. coli C600.
Одну й ту ж саму колонію переколюємо на всі чашки однією переколкою. Порядок переколювання на чашки обов`язковий.

3. Чашку №1 (матричну) інкубуємо при 28º С, а чашку №2 (з газоном чутливої культури) – при 37 ºС 8 – 12 год.

6-й день

Виділення плазмідного профага Р1

   Лізогенний клон відбирається за наступними критеріями:
- росте на МПА з хлорамфеніколом (20 мкг/мл) при 28 ºС;
- утворює зону лізиса навкруги своєї колонії на газоні індикаторної культури E. coli C600 при 37 ºС.
Джерелом біомаси лізогенних клітин для виділення плазмідного профагу слугує
матрична чашка №1. Якщо відібрана колонія сягає в діаметру 4-5 мм, то вона одразу може бути використана для виділення плазмідного профага Р1. В іншому випадку, відібраний клон необхідно відсіяти додатково. Виділення плазмідного профага здійснюється за стандартною методикою (див. нижче).

Тема: Трансформація бактеріальних клітин

 Бактеріальну трансформацію можна визначити як спадкову зміну властивостей бактерії завдяки отриманню  клітиною  ззовні молекули ДНК. При цьому бактеріальна клітина повинна бути компетентною, тобто здатною до отримання  молекули ДНК. У деяких бактерій відбувається природна трансформація, і на певному етапі росту вони стають компетентними.  Але бактеріальні клітини можна також зробити компетентними штучно, наприклад, якщо культивувати їх при 0 ºС  з CaC1₂, що може спричинити зменшення життєздатності бактеріальних клітин, але зробить їх більш компетентними для трансформації.
Дослідження систем природної трансформації призвело до створення окремих моделей того, як відбувається трансформація у грам-негативних і грам-позитивних бактерій. Але треба зауважити, що в цих системах молекула ДНК може  трансформувати реципієнтну бактерію лише за умови, що вона є гомологічною до ДНК реципієнтної бактерії і в подальшому зможе відбутися гомологічна рекомбінація. 
У штучних системах трансформації  як правило використовується плазмідна ДНК, яка здатна до самостійною реплікації у реципієнтній бактеріальній  клітині, що не потребує процесу гомологічної рекомбінації.

1-й день

Хід роботи
Знімають окрему бактеріальну колонію реципієнтного штаму E. coli з чашки з LB-агаром, яка інкубувалась при 37 ºС 16-24 год, і переносять в 5 мл рідкого середовища LB. Інкубують ніч при 37 ºС та сильній аерації (200 об/хв на круговому шейкері) .

2-й день. Одержання компетентних клітин E. coli з використанням хлористого кальцію та їх трансформація

Хід роботи

1. 1 мл нічної культури реципієнтного штаму розводять у 100 разів рідким середовищем LB і інкубують при 37 ºС та сильній аерації 2 год.
2. Культуру переносять у стерильні охолоджені центрифужні пробірки і охолоджують до 0ºС на крижаній бані 10 хв.
3. Клітини осаджують центрифугуванням при 4300 g, 5 хв при 4 ºС.
4. Зливають надосад і перевертають пробірку на 1 хв для повного зтікання.
5. Ресуспендують клітинний осад в 1 мл крижаного 0,1 М CaCl₂ з обережним струшуванням. Інкубують на крижаній бані 30 хв.
6. Осаджують клітини центрифугуванням при 4300 g, 5 хв при 4 ºС, зливають надосад і перевертають пробірку (як в пп..3, 4)
7. Ресуспендують осад в крижаному 0,1 М CaCl₂ (з розрахунку 2 мл хлористого кальцію на 50 мл вихідного об`єма культури). До використання суспензію рекомендується залишити при 4ºС на 1 год. При такій температурі її можна зберігати до 48 год, але вже після 24 год зберігання ефективність трансформації буде падати. Суспензію клітин також можна розлити на аліквоти і зберігати при – 70 ºС.
8. Охолодженою стерильною насадкою переносять 200 мкл суспензії компетентних клітин у стерильний еппендорф. Додають надспіралізовану плазмідну ДНК, але на більше 50 нг в об`ємі не більше 10 мкл. Обережно перемішують і 30 хв інкубують на крижаній бані.

Контроль – компетентні клітини, до яких не додавалась плазмідна ДНК.

9. Пробірки переносять на 90 сек на водяну баню з температурою 42 ºС. Пробірки не струшують!
10. Швидко переносять пробірки назад на крижану баню і інкубують 2 хв.
11. Додають до кожної пробірки 800 мкл LB-середовища. Для індукції експресії маркера стійкості до антибіотика, який кодується плазмідою, інкубують пробірки 45 хв при 37 ºС.
12. Переносять 100 мкл трансформованих клітин на чашки з агаризованим LB-середовищем, що містить відповідний антибіотик. Рівномірно розтирають шпателем Дригальського. Дають підсохнути при кімнатній температурі.
13. Інкубують при 37 ºС. Колонії трансформантів можна побачити через 12-16 год. Для виділення плазмідної ДНК використовують метод Кадо і Ліо (див. нижче).

Тема: Трансдукція транспозону Tn9 бактеріофагом Р1 у клітини Erwinia carotovora

  Кільцеві позахромосомні ДНК з невідомими функціями широко розповсюджені у Erwinia carotovora subsp. carotovora. Ці генетичні елементи являють собою криптичні плазміди, через те що невідома жодна фізіологічна функція, яку вони кодують. Дуже зручним, а іноді єдиним засобом вивчення фізіології та генетики криптичних плазмід є транспозонний мутагенез. Штам ЕСА 48А утримує багатокопійну плазміду рСА25 з розміром 9,8 т.п.н. Раніше було показано, що клітини ЕСА 48А чутливі до зараження коліфагом Р1. Повноцінної внутриклітинної репродукції фага не відбувається. Однак спостерігається ефективне “вбивство клітин зовні”. Значна частина клітин, які виживають, стає стійкою до хлорамфеніколу. Це свідчить про Р1-трансдукцію, пов’язану з лізогенізацією клітин фагом Р1.
  У ході вивчення плазмідних спектрів Р1-трансдуктантів було виявлено клон ЕСА 48А-7/4b.  Клітини клону  7/4b утримували позахромосомну ДНК збільшеного розміру. Збільшення розміру плазміди рСА25 у клітинах клону 7/4b дійсно пов’язано зі вставкою транспозона Tn9, який несе ген хлорамфеніколацетилтрансферази. Збільшення ампліфікації плазміди з транспозоном збільшує дозу хлорамфеніколацетилтрансферази. Транспозонмічені клони можуть бути відібрані в умовах більш суворого селективного пресу, ніж Р1-трансдуктанти. Встановлено, що бактерії, які несуть плазміду з транспозоном, здатні виживати при концентраціях хлорамфеніколу 100 мкг/мл і більше. Р1-трансдуктанти при цих концентраціях антибіотика гинуть. 
  Таким чином, суть методу полягає в тому, що збільшення копійності плазміди збільшує також і дозу гена хлорамфеніколацетилтрансферази і відповідно дозу самого ферменту. Це дозволяє транспозонміченим клонам виживати при високих концентраціях антибіотика.

1-й день Приготування добової культури  E. carotovora 48A

Хід роботи
Окрему бактеріальну колонію культури  E. carotovora 48A (з чашки) переносимо у 3 мл МПБ. Інкубуємо 18-24 год при 28º С.

2-й день Лізогенізація клітин E. carotovora 48А коліфагом Р1

Хід роботи

1. Добову культуру E. carotovora 48A розводимо у 20 разів. Для цього до 3 мл МПБ додаємо 150 мкл добової культури. Інкубуємо 3 год до концентрації 2х10⁸ кл/мл при 28ºС.
2. Стовпчик з МПА 0,5% (5 мл) розплавляємо на водяній бані (воду доводимо до кипіння і кип`ятим 0,5 – 1 [d).
3. Оступаємо водяну баню зі стовпчиком до 55º С.
4. У стовпчик МПА 0,5% додаємо 300 – 400 мкл 3-годиної культури E. carotovora 48A (яка знаходиться  у початковій або середній фазі росту), перемішуємо і акуратно  наносимо на шар нижнього агару (МПА 1,5%).
5. Даємо застигнути при кімнатній температурі.
6. На верхній агаровий шар наносимо краплі фаголізату об’ємом по 10 мкл.

7. Після висихання  п’ятен  чашки  Петри переносимо у термостат і інкубуємо 18 – 20 год при   28 °С.

3-й день Перенесення лізогенів по Р1 у мінімальне середовище

Хід роботи

1. Вирізаємо із лізогеної плями кубик 5*5 мм.
2. Переміщуємо кубик у флакон з 3 мл мінімального середовища для відмивання трансдуктантів на 8 і 24 год при 28 °С.

4-й день Нанесення трансдуктантів  на середовище з антибіотиком (хлорамфенікол)

Хід роботи

1. З флакону з мінімальним середовищем на чашку з Cm капаємо по 10 мкл.
2. Інкубуємо 1-2 доби у термостаті при 28ºС.

5-й день Пересів трансдуктантів на чашки з Cm (100 мкг/мл).

Хід роботи

За допомогою мікробіологічної петлі пересіваємо трансдуктантів на середовище з  Cm (100 мкг/мл) для відбору трансдуктантів з плазмідою    pCA25::Tn 9.

 6-й день

Хід роботи
Електрофорез плазмідних ДНК у агарозному гелі.

Тема: Екстракція плазмідної ДНК за методом Кадо і Ліо

 Плазміди являють собою самореплікативні, позахромосомні молекули ДНК, які зустрічаються  у клітинах грамнегативних і  грампозитивних бактерій, а також у деяких дріжджів та грибів. Більшість їх представлена у вигляді ковалентнозамкнених  кільцевих дволанцюгових молекул ДНК. Молекулярний розмір плазмід може коливатися від однієї до декількох сотень т.п.н. Кількість копій плазмід є сталою характеристикою і коливається для різних плазмід від однієї до декількох сотень копій на клітину. Нещодавно у різних бактерій були також виявлені лінійні плазміди. Взагалі плазміди не є суттєво необхідними для виживання своїх хазяїв, але вони можуть нести широкий спектр генетичних детермінант, які надають їм  перевагу у пристосуванні до умов оточуючого середовища та роблять їх більш конкурентноспроможними відносно інших мікроорганізмів, які займають ту ж саму екологічну нішу. Важливу роль у природі відіграють бактеріальні плазміди, які несуть гени стійкості до антибіотиків, а також гени специфічних факторів вірулентності. Для реплікації плазміди за звичай використовують бактеріальні гени, не дивлячись на те, що самі вони кодують специфічні молекули необхідні для ініціації їх реплікації. Реплікація плазмід починається у сайті, який має назву ori, і може здійснюватись за механізмом кільця, що котиться, або за тета-типом. Деякі елементи, необхідні для реплікації плазмід, наприклад, молекули антисенсової РНК та послідовності повторів ДНК, розташовані на плазмідній ДНК поряд з сайтом ori, визначають такі властивості плазміди, як копійність і несумісність.

Хід роботи

1. Біомаса клітин ресуспендується в 100 мкл буфера Е. Розмір окремої колонії повинен складати 4-6 мм.
2. До суспензії додають подвійний об`єм (200 мкл) лізуючого буферу Кадо. Суміш інкубують при 60 ºС 45 хв.
3. До лізату додають подвійний об`єм суміші кислого фенолу і хлороформу (1:1). Обережно змішують та центрифугують при 11000 об/хв. 5 хв. Суміш повторно обережно струшують і повторюють центрифугування.
4. Супернатант з плазмідною ДНК відбирають у чисту пробірку, не захоплюючи осад на інтерфазі. Зберігають при +4 ºС.
5. Одержані зразки аналізують за допомогою гель-електрофорезу (0,9% агарози в буфері Е), при U=40-60 V і довжині агарозного геля 6-10 см. Перед внесенням в гель, зразки забарвлюють стоп-буфером для рестрикції (див. рестрикційний аналіз ДНК фага Т7).

 Лізуючий буфер Кадо для виділення плазмідної ДНК:
На 100 мл дистильованої Н₂О: Tris – 605 мг; SDS – 3 г; 2N NaOH – 3 мл. Профільтрувати.
Буфер Ех1:
40 мМ Трис-Ацетат, рН 7,9
2мМ Na₂ЕДТА
Готують 20-кратний буфер, який використовують для приготування агарози, одно-кратного буфера для електрофорезу, виділення плазмід. 
0,9% гель агарози: дистильованої Н₂ О - 190 мл, агароза – 1,8 г. Агарозу розчиняємо на водяній бані, додаємо
10 мл буфера Ех2 і доводимо до кипіння на плитці.
Гель формуємо з агарози, охолодженої до 55 ºС. Камеру заповнюємо буфером Ех1.
Для візуалізації результатів електрофоретичного розділення агарозний гель фарбуємо розчином броміду етидію (1 мкг/мл) впродовж 20 хв. Після цього гель відмиваємо від зайвого барвника в дистильованій воді 20 хв.

Виявлення генетичних послідовностей методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР)